Apa itu Spektrofotometer?

          Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar,1990). Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sementara sinar tampak mempunyai panjang gelombang 400-800 nm (Ditjen POM, 1995). Berikut ini adalah uraian bagian-bagian spektrofotometer. 

1. Sumber-sumber lampu; lampu deutrium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang antara 350-900 nm).

2. Monokromator: digunakan untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya dapat berupa prisma ataupun grating. Untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian.

3. Sel absorpsi: Pada pengukuran didaerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal kuvet adalah 10 mm, tetapi yang lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan. Sel yang biasa digunakan berbentuk persegi, tetapi bentuk silinder dapat juga digunakan. Kita harus menggunakan kuvet yang bertutup untuk pelarut organik. Sel yang baik adalah kuarsa atau gelas hasil leburan serta seragam keseluruhannya

4. Detektor: Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang (Khopkar, 1990; Rohman, 2007).

Penyerapan radiasi oleh Molekul

            Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa fenomena. (1) molekul secara keseluruhan dapat bergerak yang kejadian ini disebut dengan translasi; energi yang berhubungan dengan translasi disebut dengan energi translasional, E _trans; (2) bagian molekul (atom atau sekelompok atom) dapat bergerak karena berkenaan satu sama lain. Gerakan ini disebut dengan vibrasi dan energinya dinamakan dengan energi vibrasional, E_vibr; (3) molekul dapat berotasi pada sumbunya dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional, E_rot; (4) disamping bentuk gerakan – gerakan tersebut, suatu molekul memiliki konfigurasi elektronik, dan energinya (energi elektronik, E_elek) tergantung pada keadaan elektronik molekul. Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian, spektra ultraviolet dan spektra tampak dikatakan sebagai spektra elektronik. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik maka molekul tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik yang energinya sesuai. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi. Apabila pada molekul yang sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan garis spektrum.

Pada kenyataannya, spektrum UV – Vis yang merupakan korelasi antara absorbansi (sebagai ordinat) dan panjang gelombang (sebagai absis) bukan merupakan garis spektrum akan tetapi merupakan suatu pita spektrum. Terbentuknya pita spektrum UV-Vis tersebut disebabkan oleh terjadinya eksitasi elektronik lebih dari satu macam pada gugus molekul yang sangat kompleks. Terjadinya dua atau lebih pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi sehingga mempunyai lebih dari satu panjang gelombang maksimal (Rohman, 2007). Kromofor adalah bagian molekul yang mengabsorpsi dalam daerah ultra violet dan daerah sinar tampak. Dalam satu molekul dapat dikandung beberapa kromofor. Sebagai contoh C=O, dan NO₂ . Dilihat dari struktur kaptopril yang mempunyai kromofor (C=O), maka senyawa ini dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet. Pada gugus karbonil, disamping mempunyai sepasang elektron sigma dan sepasang elektron pi, juga terdapat dua pasang elektron bebas, sehingga dapat terjadi beberapa transisi (Silverstein, 1986). Menurut hukum Lambert, serapan (A) berbanding lurus dengan ketebalan lapisan (b) yang disinari :

A = k.b

 Dengan bertambahnya ketebalan lapisan, serapan akan bertambah. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya monokromatis dan larutan yang sangat encer, serapan (A) dan konsentrasi (c) adalah :

A = k.c

Jika konsentrasi bertambah, jumlah molekul yang dilalui berkas sinar akan bertambah, sehingga serapan juga bertambah. Kedua persamaan ini digabungkan dalam hukum Lambert-Beer, maka diperoleh bahwa serapan berbanding lurus dengan konsentrasi dan ketebalan lapisan: A = k.c.b Umumnya digunakan dua satuan c (konsentrasi zat yang menyerap) yang berlainan, yaitu gram per liter atau mol per liter. Nilai tetapan (k) dalam hukum Lambert-Beer tergantung pada sistem konsentrasi mana yang digunakan. Bila c dalam gram perliter, tetapan disebut dengan absorptivitas (a) dan bila dalam mol per liter tetapan tersebut adalah absortivitas molar (Є). Jadi dalam sistem dikombinasikan, hukum Lambert-Beer dapat mempunyai dua bentuk: A = a.b.c g/liter atau A = Є . b. C mol/liter Penandaan lain untuk a adalah ekstingsi spesifik, koefisien ekstingsi, dan indeks absorbansi, sedangkan Є adalah koefisien ekstingsi molar (Day and Underwood, 1999; Rohman, 2007)). Beberapa pengertian istilah dalam spektrofotometri

a. Kromofor, adalah suatu gugus atom yang menyebabkan terjadinya absorpsi cahaya.

b. Auksokrom, adalah suatu gugus atom yang apabila terikat kepada suatu kromofor akan menambah panjang gelombang dan intensitas resapan maksimum (absorbans) ke arah panjang gelombang yang lebih panjang.

c. Efek batokrom, adalah pergeseran panjang gelombang resapan maksimum kearah panjang gelombang lebih panjang. Disebut juga Red Shift Effect.

d. Efek hipsokrom, adalah pergeseran panjang gelombang yang lebih pendek. Disebut juga Blue Shift Effect.

e. Efek hipokrom, adalah pergeseran intensitas resapan kearah intensitas yang lebih kecil.

f. Efek hiperkrom, adalah pergeseran intensitas resapan ke arah intensitas yang lebih besar ( Silverstein, 1986).

Hal–hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektofotometri ultraviolet a. Pemilihan panjang gelombang maksimum Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.

b. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing – masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi berupa garis lurus.

c. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15 % sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal (Rohman, 2007).